久坂玄瑞在信中骈四俪六地抒发了自己的攘夷志向。自小就是优等生的他自信满满，以为一定会得到吉田松阴的夸奖。几天之后，朋友带来吉田松阴的回信。久坂玄瑞满心欢喜地展信一看，却看到吉田松阴在信中批评他“议论浮泛、思虑粗浅，言不由衷”。其实，吉田松阴看了书信后，很为久坂玄瑞诚恳的攘夷志向感动，也觉得他很有文采。但久坂玄瑞还年轻，有些年少气盛，吉田松阴便想通过打击他的方式挫挫他的锐气，让他能沉静下来，认真思考自己的言论正确与否。久坂玄瑞受了打击，但并不服气，当晚就撰写了反驳信。两人书信来往了很久，直到安政四年（1857年）的晚春，吉田松阴才终于同意收他为徒。久坂玄瑞进了松下村塾后，又将自己的少时好友高杉晋作也拉了进来。

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　　在松下村塾，久坂玄瑞和高杉晋作成绩优秀，被周围人们称为“村塾双璧”。他俩也和吉田稔麿、入江九一一起被合称为“松门四天王”。在松下村塾中，久坂玄瑞等四人暗中较劲，拼命想获得老师吉田松阴的称赞。但在这四人中，吉田松阴最寄予厚望的当属久坂玄瑞。
　　同在松下村塾学习的山县有朋曾经说过这样一件逸事：有一天，松下村塾的其他学生都出去了，只有吉田松阴和当时尚是懵懂少年的山县有朋呆在教室里。吉田松阴在纸上作画，山县有朋立在他身边观看。
　　只见松阴先生先在纸上画了一头暴戾的牛，又画了一个身穿礼服、威风凛凛的的人，然后画了一把木刀，木刀后面是一根棒子。山县有朋不解其意，央求松阴老师给自己解释。吉田松阴微笑着解释道，牛是高杉晋作，脾气暴躁，他人难以驾驭。穿礼服的人是久坂玄瑞，将来定会成为朝堂之上的堂堂政治家。而木刀是入江九一，看起来锋利无比，其实是木头所制。而最后的那个棒子是你，山县有朋。

　　在回忆到此事时，当时已是耄耄老者的山县有朋仍面带愧色。也许当时的山县有朋确实是受到了伤害，但是，我们可以看出，久坂玄瑞是吉田松阴最喜爱的学生。
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　　松下村塾有诸多弟子，吉田松阴将妹妹杉文许配给久坂玄瑞为妻，只怕也是出于这份喜爱之情。杉文是吉田松阴最宠爱的妹妹，吉田松阴郑重嘱托中谷正亮为媒，让他向久坂玄瑞提亲。但是，谁也未曾想到，久坂玄瑞非但没有感激涕零，反而一口回绝——年少轻狂的他嫌杉文不够美貌。不过，顾念着师徒之情，久坂玄瑞还是答应了这门亲事。安政四年（1857年）12月5日，久坂玄瑞和杉文结了婚。

　　安政五年（1858年），为了继续学习医学知识，久坂玄瑞离开长州，赶往京都。不久他又去往江户继续学习。久坂玄瑞刚到江户不久，便听同门说师父吉田松阴计划暗杀幕府老中。久坂玄瑞大惊失色，他匆匆写信，催促松下村塾的学生们联名劝说吉田松阴，让他冷静下来，放弃暗杀计划。热血沸腾的吉田松阴接到信后十分气愤，扬言要和学生们断交。一向成熟稳健的吉田松阴，也有气急败坏的时候。

　　可是，不久之后，受活跃在京都的攘夷志士梅田云浜的牵连，“安政大狱”的风暴也吹到了长州。被怀疑与攘夷志士私下交往的吉田松阴被押往江户，随后便被判了斩刑。
　　久坂玄瑞痛失恩师，惊怒交集。他将素日爱读的洋书全部付之一炬，从此下了倒幕的决心，和松下村塾的其他学生一起投入尊王攘夷运动中。
　　久坂玄瑞虽然烧了洋书，却并不是顽固的攘夷分子。他在给朋友的信中说：“日本即使洋枪大炮俱备，也不能真正胜过洋人”“攘夷从一开始便无胜算。之所以攘夷，是要改变日本，攘夷乃是道义的旗帜。”由此可见，素来清醒的久坂玄瑞绝非热血派，他很冷静地看透了当时日本的时局。他并不是真心攘夷，而想通过攘夷排除幕府势力，真正改变日本现状。
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　　文久元年（1861年），深得长州藩主毛利敬亲信任的长井雅乐提出了《航海远略策》，主张结合幕府与朝廷力量，共度时艰。长州藩论也开始向公武合体倾斜。文久二年（1862年），高举尊王攘夷大旗的久坂玄瑞和松下村塾出身的同志们不愿被长井雅乐坏了大事，一起向藩主毛利敬亲提出了针对长井雅乐的弹劾书。

　　不久，学识渊博的久坂玄瑞受到藩主推荐，前往京都的学习院进行辅助工作。学习院是京都的皇族显贵们的学习场所，仅是一介藩士的久坂玄瑞能在学习院里任职，算是难得的荣耀。久坂玄瑞学问精深，又是坚定的尊王攘夷派，他深得公卿们的信赖，成为攘夷公卿与长州藩沟通的桥梁。
　　久坂玄瑞在京都，他的同志们却没放过长井雅乐。他们不断联系长州藩藩臣，力图使长州藩放弃公武合体路线。在桂小五郎等人的努力下，藩主毛利敬亲舍弃了《航海远略策》，藩论也随之一变，长州藩成为尊王攘夷的拥护者。
　　长州藩藩论已定，剩下的就是具体的攘夷行动了。文久三年（1863年）的正月，已经回到长州的久坂玄瑞去好友家拜年。两人畅谈国事，不知不觉已经到了晚饭时分。女眷端上杂煮（日本菜，中有年糕等食材），两人边吃边聊。久坂玄瑞胃口极好，连续吃了30块年糕。年糕为江米所制，不易消化，略有些担心的女眷询问久坂玄瑞怎么如此胃口大开，久坂玄瑞半开玩笑地说：“在下不久便要再去京都。京都时局险恶，可能一去不回，今天便在贵处吃尽余生的年糕。”

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　　文久三年（1863年）5月，久坂玄瑞从京都返回长州，与高杉晋作等志士一起炮击通过长州关门海峡的外国船只。受到炮击的外国列强不甘示弱，终于起了国际纠纷。本来在风雨飘摇中的日本，被战争搅得一片混乱。
　　长州藩打着尊王攘夷的旗号，却屡行偏激之事，连身在京都的孝明天皇也不悦起来。善于察言观色的中川宫朝彦亲王联合朝廷中的公武合体派公卿，借助了萨摩藩和会津藩的力量，成功实施了旨在排挤尊王攘夷势力的“八一八之变”。朝廷中的尊王攘夷公卿被赶出京都，长州藩势力也被一扫而清。
　　京都局势异常险恶，大多数攘夷志士都离开京都避祸。久坂玄瑞坚持留下，希望依靠自己的人脉为长州藩分说，让天皇宽恕长州藩的罪过。但是，长州藩中的激进派来岛又兵卫却提议重新率兵入京，当面向天皇诉说长州的冤屈。久坂玄瑞坚决反对，桂小五郎也全力阻止，来岛又兵卫才暂时安定了下来。
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　　元治元年（1864年）6月5日，京阪地区的攘夷志士们在京都池田屋中聚会，计划暗杀公武合体派公卿。谁知会议消息泄露，新选组杀气腾腾地冲进池田屋，大肆砍杀志士。吉田稔麿、宫部鼎藏等长州志士不幸殒命。噩耗传来，长州藩士们悲愤交集，来岛又兵卫等人再次提出要率军入京。
　　久坂玄瑞认为现在京都的形势对长州极为不利，长州藩想要扭转劣势，必须放下身段，先奉上请求饶恕的《叹愿书》，同时拉拢同情长州藩的公卿，才能跳出被群起而攻之的恶劣环境。可是，《叹愿书》递交之后，孝明天皇虽然略略消了心头恶气，但看见长州藩军队仍在京都附近，便严命长州藩立刻退回长州。7月12日，全副武装的萨摩藩兵进入京都守护。“八一八之变”后，长州藩视萨摩藩为不共戴天的仇敌，仇人相见，分外眼红，长州藩内的过激派们一下炸了锅。

　　京都气氛越来越紧张。江户幕府也给各藩下令，令他们率兵入京都参与保卫。战争一触即发，空气中都弥漫着紧张的气氛。7月17日，长州藩志士们在石清水八幡宫召开了最后的军事会议。主战派们摩拳擦掌，要求即刻发兵。而久坂玄瑞仍然立场不改，他认为长州藩入京本是为了辩白，并不是为了作战。况且，长州藩孤立无援，京都中各藩环视，一旦战火燃起，长州藩寡不敌众，毫无胜算。